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星空app:甲磺酸伊马替尼的生物活性和实验方法

发布时间:2018-10-24 13:45:35 编辑作者:活性达人

甲磺酸伊马替尼图片

图片:甲磺酸伊马替尼结构式

甲磺酸伊马替尼是具有抗肿瘤活性的特异性酪氨酸激酶受体抑制剂,用于治疗费城染色体阳性慢性髓性白血病和胃肠道间质瘤。

一、甲磺酸伊马替尼的生物活性详解:
1)体外活性
甲磺酸伊马替尼抑制c-Kit自身磷酸化,MAPK活化和Akt活化而不改变c-kit,MAPK或Akt的总蛋白水平。对这些影响产生50%抑制的浓度约为100 nM [1]。甲磺酸伊马替尼对慢性粒细胞白血病激酶Bcr-Abl非常有效(体外IC50为25 nM)。伊马替尼还有效抑制Kit(体外IC50,410 nM)和PDGFR(体外IC50,380 nM)[2]。甲磺酸伊马替尼是v-Abl,c-Kit的多靶点抑制剂,抑制Bcr / Abl,v-Abl,Tel / Abl,天然PDGFβ受体和c-Kit,但它不抑制Src家族激酶,c-Fms,Flt3,EGFR或多种其他酪氨酸激酶。伊马替尼抑制表达Bcr / Abl,Tel / Abl,Tel /PDGFβR和Tel / Arg的Ba / F3细胞的酪氨酸磷酸化和细胞生长,每种情况下IC50约为0.5μM,但对未转化的Ba / F3没有影响。细胞生长在IL-3或通过Tel / JAK2转化的Ba / F3细胞[3]。甲磺酸伊马替尼选择性地抑制Bcr / Abl,c-Kit和PDGFR激酶的活性。甲磺酸伊马替尼在慢性粒细胞白血。–ML)和费城阳性(Ph +)急性淋巴细胞白血。ˋLL)中显示出明显和快速的抗白血病活性[4]。

2)体内活性
用甲磺酸伊马替尼治疗的动物在整个研究中显示平均体重减少。 在接受化疗和维生素D类似物联合治疗的小鼠中,体重减轻是显着的。 在实验的第22天,用甲磺酸伊马替尼和PRI-2191联合治疗的小鼠体重减轻最高(15%),但在那天之后,小鼠开始恢复[4]。 在大鼠缺血/再灌注损伤(IRI)模型中,甲磺酸伊马替尼通过抗渗透和抗炎作用减弱肺损伤。 在该模型中也证实了甲磺酸伊马替尼在肺中的传递和功能[5]。

二、甲磺酸伊马替尼的实验方法:
1)动物实验
小鼠[4]-使用12-16周龄,体重20-25g的NOD / SCID雌性小鼠。用A549肿瘤细胞悬浮液(每只小鼠0.2mL Hank培养基中5×10 6个细胞,第0天)将小鼠皮下(sc)接种在腹部右侧,然后随机分成接受维生素D类似物的不同组合的组和化疗。在相应的实验中应用两个实验方案中的一个:1。在接种肿瘤细胞后(当肿瘤变得可触知时)从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以75mg / kg /天的剂量腹膜内(i.p.)给药,每天给药19天(从第7-25天开始)。 PRI-2191由s.c.管理。或者以2μg/ kg /天的剂量口服强饲法,每周3次(第7,12,14,16,19,21和23天)。 2.在接种肿瘤细胞后(当肿瘤变得可触知时)从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以50mg / kg /天的剂量腹膜内(i.p.)给药,每天给药13天(从第7-19天开始)。 PRI-2191和PRI-2205是s.c.剂量为1或10μg/ kg /天,分别为每周3次(第7,10,12,14,17,19,21,24和26天)。在实验结束时,在麻醉下收集血液;然后,将小鼠处死。

大鼠[5]-在实验中使用重270至320g的雄性Lewis大鼠。在伊马替尼组(n = 7)腹膜内注射甲磺酸伊马替尼(50mg / kg),在载体组中给予0.5mL不含伊马替尼的20%DMSO(n = 7)。初步测试25mg / kg的剂量,并且其在肺功能方面产生少许改善而没有统计学意义。基于该结果和过去的报道,采用50mg / kg的剂量和腹膜内给药。将动物进行左胸廓切开术,并用小金属夹闭塞左肺门。在伊马替尼或载体给药后20分钟进行闭塞。夹紧期间,潮气量(TV)和呼吸频率(RR)分别调整为8 mL / kg和80次/ min。缺血90分钟后,取出夹子并保持再灌注120分钟。在再灌注期间,双侧肺中的血流和通气恢复。在假手术组(n = 6)中,将动物肝素化,胸腔切开并通气210分钟。

2)细胞实验
将BON-1细胞和NCI-H727细胞一式三份接种到平底96孔板中,并分别在10%胎牛血清补充的DMEM或RPMI 1640完全培养基中粘附过夜; 然后将培养基更换为含有连续稀释的伊马替尼的无血清培养基(阴性对照)或无血清培养基。 48小时后(对照培养物未达到汇合),通过溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓测定法测定代谢活性细胞的数量,并测定吸光度。 Packard Spectra酶标仪,540 nm。 使用下式计算生长抑制:抑制率=(1-a / b)×100%,其中a和b分别是处理组和对照组的吸光度值。

3)激酶实验
PDGF受体从BALB / c 3T3细胞提取物中免疫沉淀,其具有针对鼠PDGF受体的兔抗血清,在冰上2小时。 蛋白A-Sepharose珠用于收集抗原 - 抗体复合物。 用TNET(50mM Tris,pH 7.5,140mM NaCl,5mM EDTA,1%Triton X-100)洗涤免疫沉淀物两次,用TNE(50mM Tris,pH 7.5,140mM EDTA)洗涤一次,并用 激酶缓冲液(20mM Tris,pH 7.5,10mM MgCl 2)。 在4℃下用PDGF(50ng / mL)刺激10分钟后,向反应混合物中加入不同浓度的药物。 通过与10μCi[7-33P] -ATP和1μMATP在4℃温育10分钟来确定PDGF受体激酶活性。 通过SDS-PAGE在7.5%凝胶上分离免疫复合物。

综上所述:甲磺酸伊马替尼是 c-Kit,Bcr-Abl 和 PDGFR 酪氨酸激酶抑制剂,抑制 SLF 非依赖性的 c-Kitwt 激酶激活,IC50 为 100 nM。它的靶点活性为c-Kit,100nM;PDGFR,100nM;v-Abl,600nM。

参考文献:
[1]. Heinrich MC, et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 2000 Aug 1;96(3):925-32.
[2]. Guida T, et al. Sorafenib inhibits imatinib-resistant KIT and platelet-derived growth factor receptor beta gatekeeper mutants. Clin Cancer Res. 2007 Jun 1;13(11):3363-9.
[3]. Okuda K, et al. ARG tyrosine kinase activity is inhibited by STI571.Blood. 2001 Apr 15;97(8):2440-8
[4]. Maj E, et al. Vitamin D Analogs Potentiate the Antitumor Effect of Imatinib Mesylate in a Human A549 Lung Tumor Model. Int J Mol Sci. 2015 Nov 13;16(11):27191-207.
[5]. Tanaka S, et al. Protective Effects of Imatinib on Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Lung. Ann Thorac Surg. 2016 Jul 23. pii: S0003-4975(16)30523-9
[6]. Meirson T, et al. Targeting invadopodia-mediated breast cancer metastasis by using ABL kinase inhibitors. Oncotarget. 2018 Apr 24;9(31):22158-22183.

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